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本试剂盒是一种利用荧光染料DCFH-DA进行细胞内活性氧水平检测的常用方法。检测原理在于DCFH-DA本身无荧光，能自由穿过细胞膜，一旦进入细胞后，被胞内的酯酶水解生成无荧光的DCFH。DCFH不能穿透细胞膜，从而保留在胞内。此时胞内的活性氧可以氧化DCFH生成有荧光的DCF。通过DCF荧光的强弱即可反映活性氧的水平。因检测对象和反应体系的不同，本试剂盒可检测100～500个样品。

试剂盒组成：

组分	规格
活性氧探针DCFH-DA(10mM)	100μL
活性氧阳性对照(50mg/ml)	1mL

保存：-20oC保存，有效期一年。

使用方法：

一、装载探针
对于刺激时间较短（通常2h以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照和/或待研究药物刺激细胞；对于刺激时间较长（通常6h以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或待研究药物刺激细胞，后装载探针。

A．原位装载探针（仅适用于贴壁细胞）

• 检测前一天进行细胞铺板，确保活性氧检测当天细胞汇合率达到50～70%。
  
• 吸出细胞培养液，加入适量体积以及浓度的待研究药物，于37oC细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。
  （可选）设置阳性对照：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20～30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异（刺激时间可参考文献或实验经验来调整）。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高阳性对照的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低言行对照的工作浓度。
  
• 按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM.。吸出细胞培养液，加入适当体积DCFH-DA工作液。
  注意：加入体积以能充分盖住细胞为宜。对于6孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于1mL。对于96孔板，每个孔加入DCFH-DA工作液不少于0.1mL。
  
• 37℃细胞培养箱内孵育20min。
  
• 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

B．收集细胞后装载探针

• 按照常规方法，清洗并收集足量的细胞。
  注意：保证细胞的状态健康。
  
• 用适量体积以及浓度的待研究药物重新悬浮细胞，于37℃细胞培养箱内孵育，具体诱导时间根据细胞类型和药物自身特性决定。
  （可选）设置阳性对照：先用无血清培养液按照1:1000比例稀释阳性对照，通常37℃培养箱内刺激20～30min可以观察到显著的活性氧水平提高，但依细胞类型会有比较明显差异（刺激时间可参考文献或实验经验来调整）。如果刺激后30min内未观察到活性氧水平升高，可以适当提高阳性对照的工作浓度；反之，如果活性氧升高过快，则适当降低阳性对照的工作浓度。
  
• 探针装载前，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA（10mM），使其终浓度为10μM.。
  
• 离心，吸出细胞内刺激药物，之后用适量DCFH-DA工作液重悬细胞，使得细胞密度为1×10⁶～2×10⁷/ml。
  注意：细胞密度需根据后续检测体系，检测方法，以及检测总量来调整。例如，对于流式分析，单管检测内细胞数目控制在104～106之间。
  
• 37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3～5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
  
• 用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。

二、检测

• 原位装载法
  可用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
  
• 收集细胞后装载法
  可用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可用激光共聚焦显微镜直接观察。

三、参数设置
使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可用FITC的参数设置检测DCF。

注意事项：

• 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
  
• 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。
  
• 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。
  
• 对于某些细胞，若发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1:2000～1:5000稀释DCFH-DA，使DCFH-DA的工作浓度为2～5μM。探针装载时间也可依情况在15～60min内适当进行调整。

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